浙江强基联盟高三模拟题第24题(MLPA技术论断遗传病)深度解析

MLPA主要用来检测基因的缺失或重复，也可检测部分点突变，图中分5步：

1. 变性 ：样本基因组DNA高温变性，双链解开变成单链。

2. 杂交：针对每一个目标序列，设计一对探针。

探针内侧：杂交序列，和基因组目标序列互补配对；探针外侧：通用PCR引物结合区（黑色段，所有探针共用同一套上下游引物）；间隔序列（绿色）：不同目标探针的间隔序列长度不一样，最终产物长度不同，用来区分不同靶点。图中有目标序列A、B两组探针，A和B的绿色间隔序列长短不同。

3. 连接：当一对探针完美杂交在目标DNA 时，两个探针的末端紧紧相邻。加入热稳定DNA连接酶，把相邻的两个探针共价连接成一条完整的单链。

如果目标序列发生突变（如碱基缺失或替换），探针不能完美匹配，连接酶无法连接，不会产生可扩增模板。

4. PCR扩增：所有成功连接的完整探针，都使用同一对通用PCR引物扩增。

因为不同靶点探针的绿色间隔序列长度不同，扩增出来的产物片段长度各不相同，产物范围一般130–480bp，每一个目标位点对应一个独特长度的扩增片段。

5. 毛细管电泳分析扩增产物：PCR产物用毛细管电泳分离，得到电泳峰图：峰的位置：对应片段长度，代表是哪一个目标基因；峰的高度（峰面积）：代表该片段的量，对应目标序列的拷贝数；将待测样本峰高和正常对照DNA比较：峰高下降提示基因缺失；峰高上升提示基因重复。

（1）在变性过程中，DNA在高温下断裂，解旋成DNA单链。变性后加入含左、右探针的缓冲液并降低使探针与靶序列进行杂交。待充分杂交后加入DNA连接酶进行连接反应。连接反应结束后需加热反应液使DNA连接酶，再进行后续步骤。

答案：氢键    温度   失活

解析：高温变性破坏的是碱基对之间的氢键，DNA双螺旋解开成单链，磷酸二酯键不断裂。变性后温度很高（90℃以上），探针无法与单链DNA稳定结合。必须降低温度（复性/退火），才能让探针通过碱基互补配对结合到靶序列上。连接反应完成后，加热使DNA连接酶变性失活，防止它在后续PCR过程中干扰反应（也可理解为终止连接反应）。

（2）在PCR扩增时，原料是，模板是。毛细管电泳的原理是，在高压电场的作用下，DNA片段在毛细管中迁移，迁移速度主要由其长度决定，当某长度的DNA片段通过毛细管末端的检测窗口时，检测仪根据荧光强度确定其含量。为了一次检测多个目标DNA片段，下列叙述正确的是（      ）

A.不同目标DNA片段的左、右探针总长度应有适当差异且带有荧光标记

B.需要为每个目标DNA片段设计特定序列的带荧光标记的PCR引物

C.检测仪不同时刻采集的荧光信号对应着不同目标DNA片段

D.检测仪采集到的荧光信号越强，目标DNA的拷贝数越大

答案：dNTP    左、右探针的连接物(已连接的探针)      CD

解析：PCR的原料就是四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）。模板不是基因组DNA本身，这是本题容易出错的地方。只有被DNA连接酶连成一条的完整探针，两端才有通用引物结合位点，才能作为PCR模板。未连接的两个独立探针无法被扩增——这正是MLPA能定量检测的关键设计：只有真正结合到目标DNA上并被连接成功的探针，才会被扩增。

A错误：前半句 "不同目标DNA片段的左、右探针总长度应有适当差异"是对的，毛细管电泳按长度分离，当一次检测多个目标DNA片段时，为了不同目标DNA片段能够分开，它们的左、右探针总长度应有适当差异。后半句 "且带有荧光标记"是错的。根据题意，荧光标记是加在PCR引物上的（PCR扩增时引物带荧光，新合成的链就带上荧光），不是加在探针上的。如果探针直接带荧光，探针量太少，荧光信号太弱，检测不到。

B错误：题干明确说每段探针包含 "特异性序列和通用引物序列"，所有探针用的是同一对通用引物，不需要为每个目标设计特定引物。这正是MLPA相对于传统PCR的优势：一对引物扩增所有目标。

C正确：毛细管电泳按长度分离不同的DNA片段，不同长度的片段通过检测窗口的时间不同（迁移速度由长度决定）。因此，检测仪在不同时刻采集到的荧光信号，就对应着不同长度（即不同目标）的DNA片段。

D正确：MLPA的定量原理：初始模板（连接好的探针）越多，PCR扩增产物越多，荧光越强。而初始探针量又与目标DNA的拷贝数成正比，拷贝数越多，能结合的探针越多，连接成功的探针越多，PCR产物越多，荧光越强。

（3）已知X染色体上的DMD基因发生某些外显子缺失会导致DMD症。现用一种MLPA试剂盒(含有DMD基因79个外显子和21号染色体等的探针)对某DMD症家系的一名健康孕妇及其所怀胎儿进行检测，部分结果见下表：

由结果可知，该家系的DMD基因发生了外显子的缺失。胎儿DMD基因所有外显子的荧光强度都为0.5的原因是。胎儿的产前诊断结论是。

答案：第46号    胎儿只有一条带正常DMD基因的X染色体，经探针杂交和连接反应只生成了常量一半的探针连接物     不患DMD症、患唐氏综合征

解析：先明确正常参考值：正常女性有2条X染色体→DMD基因荧光强度=1（正常值）；正常男性有1条X染色体→DMD基因荧光强度=0.5；正常21号染色体有2条→荧光强度=1。

（第一空）母亲的外显子46荧光强度只有0.5（其他都是1），说明母亲的两条X染色体中，一条X染色体的DMD基因有外显子46，另一条X染色体的DMD基因缺失了外显子46。母亲是DMD基因的携带者（杂合子），但因为她是女性，有一条正常的X染色体，所以表型正常。

（第二空）母亲的两条X染色体：一条有完整DMD基因（含外显子46），一条缺失外显子46。胎儿从母亲那里获得了有完整DMD基因的那条X染色体（因为外显子46在胎儿中也有信号，只是强度为 0.5）。胎儿的另一条性染色体是Y染色体，不含DMD基因，所以胎儿是男性（XY），只有1条X染色体上DMD基因所有外显子的拷贝数光强度为正常值的一半（0.5）。换句话说，胎儿从母亲那里继承了正常的DMD基因（外显子46没缺失），但因为是男孩（只有一条X），所以整体荧光强度是0.5。

（第三空）不患DMD症：胎儿虽然只有1条X染色体（DMD外显子荧光都是 0.5），但他从母亲那里继承的是那条正常的、有完整DMD基因的X染色体（外显子46有信号）。所以胎儿的DMD基因是正常的，不患DMD症。患唐氏综合征：21号染色体荧光强度为1.5（正常值是1，对应2条），1.5倍说明有3条21号染色体，即21-三体，唐氏综合征。