【文献复习】让细胞外囊泡变身“药物快递员”:科学家找到更高效的装载支架

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是细胞分泌的纳米级“小包裹”，天然携带蛋白质、RNA等生物分子，能在细胞间传递信息。近年来，凭借良好的安全性和天然的靶向性，EVs被视为下一代药物递送平台的潜力选手。然而，如何高效地把治疗性蛋白质“装进”EVs，一直是制约其临床转化的瓶颈。

2023年8月，瑞典卡罗林斯卡学院Samir EL Andaloussi团队在《Nature Communications》发表了一项大规模筛选研究，从244个候选蛋白中鉴定出24个具有跨细胞类型保守EV分选能力的支架蛋白，其中TSPAN2和TSPAN3表现尤为突出，装载效率甚至超越了过去广泛使用的CD63。这项研究为EV的 endogenous engineering（内源性工程化）提供了一个系统性的参考框架。

为什么需要“支架蛋白”？

要把治疗性蛋白质装入EVs，最直接的方法是在生产细胞中让目标蛋白与一个“支架蛋白”融合表达。支架蛋白天然具有被分选进EVs的能力，能像“顺风车”一样把融合的目标蛋白带入EVs内部（luminal loading）或展示在表面（surface display）。相比表面展示，腔内装载能保护货物蛋白不被降解，尤其适合需要在受体细胞胞质或细胞核中发挥功能的分子。

但问题是，目前真正被充分验证的支架蛋白屈指可数，主要局限于四跨膜蛋白家族（tetraspanins）的CD9、CD63和CD81。其中CD63-GFP融合蛋白最多只能让51%的EV颗粒携带荧光信号，效率并不理想。此前的研究最多只比较了14个候选蛋白，缺乏系统性的高通量筛选。

一个简单而巧妙的筛选 assay

研究团队设计了一套基于荧光素酶报告基因ThermoLuc（Tluc）的筛选流程。Tluc被融合到244个候选蛋白的C端，在HEK-293T细胞中表达后，通过比较“加膜裂解剂Triton X-100”与“不加”两种条件下检测到的Tluc活性差异，就能判断有多少Tluc被包裹在EV膜内——因为Tluc底物无法穿透EV膜，只有裂解膜后才能与腔内的荧光素酶反应。

这套 assay 的巧妙之处在于：它不需要繁琐的尺寸排阻色谱（SEC）分离，直接在高通量96孔板中就能区分“腔内货物”“表面货物”和“非囊泡分泌蛋白”。验证实验显示，SEC分离与未分离条件下测得的腔内Tluc比例无显著差异，证明该方法可靠且适合大规模筛选。

从244到24：跨细胞类型的保守分选蛋白

在HEK-293T细胞中，36个蛋白显示出EV分选能力（腔内Tluc比例高于零），其中包括已知的CD9、CD63、CD81、PTGFRN和病毒蛋白gag，验证了筛选方法的有效性。其余31个蛋白是首次被报道具有腔内装载能力。

更关键的是，研究团队在另外四种生产细胞（悬浮HEK-293F、间充质干细胞MSC、肝癌细胞Huh-7、小鼠肾上皮细胞TCMK-1）中重复了筛选。最终，24个蛋白在全部五种细胞中均表现出保守的EV分选能力。其中21个属于四跨膜蛋白超家族，提示这一拓扑结构对EV分选具有普遍重要性。

在这24个蛋白中，TSPAN2、TSPAN3和CD63平均表现最佳。在标准化EV生产流程下，TSPAN2和TSPAN3在每个EV中的Tluc活性分别比CD63高出1.60倍和1.34倍。单囊泡成像流式细胞术也显示，TSPAN2和TSPAN3产生的工程化EV数量约为CD63的三倍，而每个EV上的货物密度相当。

TSPAN2/TSPAN3的独特之处

研究进一步揭示了TSPAN2/TSPAN3工程化EV的分子特征。与CD63工程化EV相比，TSPAN2/TSPAN3阳性EV表面较少展示CD9/CD63/CD81这些经典EV标志物，蛋白质组也显著不同。主成分分析显示，TSPAN2、TSPAN3和CD63工程化EV各自形成不同的亚群，说明它们可能利用了不同的EV生成途径。

值得注意的是，TSPAN2和TSPAN3在野生型HEK-293T细胞来源的EV中表达量很低，这或许解释了为何它们在此前的研究中被忽视。功能上，TSPAN2被认为与少突胶质细胞分化和癌症转移有关，TSPAN3则与急性髓系白血病进展及尿外泌体相关，但它们与EV生物发生的关系此前几乎未知。

从细胞到小鼠：递送潜力验证

作为递送载体，TSPAN2/TSPAN3工程化EV在Huh-7细胞中表现出与CD63相当甚至略优的摄取效率，并能有效将腔内货物递送至溶酶体。在小鼠体内，等量（基于Tluc活性）的工程化EV静脉注射后，TSPAN2/TSPAN3工程化EV在肝脏、脾脏等器官中的分布与CD63工程化EV相似。

研究还展示了TSPAN2/TSPAN3的多功能工程化潜力：在其大胞外环（LEL）中插入白蛋白结合域（ABD）后，EV能在血浆中显著延长循环时间；插入sLex糖基配体后，EV能特异性靶向激活的内皮细胞。这表明TSPAN2/TSPAN3可同时实现表面展示和腔内装载的双重工程化。

意义与展望

这项研究是目前EV分选蛋白领域规模最大的系统性比较，为内源性EV工程化提供了宝贵的候选清单。TSPAN2和TSPAN3的发现，不仅丰富了EV装载的工具箱，也提示四跨膜蛋白家族的不同成员可能导向不同的EV亚群，为理解EV异质性提供了新线索。

当然，研究也存在局限：所有货物蛋白均融合在候选蛋白的C端，其他融合位点的效果尚不清楚；分选能力是否适用于其他类型的货物分子仍需验证；不同生产细胞的转录组和蛋白质组可能影响分选效率，某些候选蛋白（如gag）表现出明显的细胞类型依赖性。

尽管如此，这项研究无疑为EV药物递送领域注入了一剂强心针。随着更多高效支架蛋白的发现和工程化策略的优化，细胞外囊泡距离成为真正的“智能药物快递员”又近了一步。

来源：Zheng, W., Rädler, J., Sork, H. et al. Identification of scaffold proteins for improved endogenous engineering of extracellular vesicles. Nat Commun14, 4734 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40453-0